翟梅枝,郭琪,贾彩霞,张新华
(西北农林科技大学林学院,陕西杨凌712100)
摘 要:以总黄酮回收率为考察指标,研究了大孔树脂分离纯化核桃青皮总黄酮的工艺。结果表明:D101型树脂对核桃青皮总黄酮有较好的吸附分离性能,是分离纯化核桃青皮总黄酮的适宜大孔树脂;最佳工艺条件为:上柱总黄酮与干树脂质量比为1∶12,上样液质量浓度可在3. 087 5~6. 175 g/L范围内, pH值为5, 6BV(1BV=23. 7mL)的水洗后用5BV的70%乙醇洗脱。经D101处理后的核桃青皮总黄酮回收率在60%,纯度可达80%以上。该工艺简便,能有效分离纯化核桃青皮黄酮类化合物。
关键词:核桃青皮;总黄酮;大孔吸附树脂;分离纯化
中图分类号:TQ91;TQ425 文献标识码:A 文章编号:1673-5854(2008)03-0021-05
核桃(Juglans regiaLinn. )是核桃属植物中经济价值最高的一种,在我国栽培历史悠久,资源丰富,到2004年,我国核桃树的栽培面积约91. 75 hm2, 2亿株左右,面积和株数都居世界第一位,年产坚果27. 424 6万吨,核桃青皮35万吨[1]。目前核桃研究大多集中在良种选育、生理生化、栽培及病虫害防治、坚果的加工利用等方面,核桃青皮是核桃生产中的副产品,一直作为废弃物弃之不用,废弃的青皮不仅污染环境,也是自然资源的浪费。近年来大孔吸附树脂已广泛应用于植物有效成分的富集和分离[2-6],有关核桃青皮黄酮类化合物的研究目前未见报道,为了充分利用这一植物资源,本研究以总黄酮回收率为考察指标,对大孔树脂分离纯化核桃青皮中的总黄酮进行了研究。
1 实验
1.1 材料、试剂与仪器
核桃青皮:采自渭北核桃主产区黄龙县,自然晾干后,在45℃左右的烘箱中烘干,粉碎过孔径0. 84mm筛,然后密封于塑料袋内,备用; D101、LSA-21、LSA-40、XDA-1型树脂购于西安蓝晓树脂公司; LS300、LS303型树脂购于西安蓝深树脂公司;芦丁对照品,中国药品生物制品检定所;所有试剂均为西安化学试剂厂分析纯;层析玻璃柱(15mm×400mm);UV1810型紫外-可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;RE-52型旋转蒸发仪,上海医械专机厂; SHZ-Ⅲ循环水真空泵,上海锦华层析设备厂。
1.2 方法
1.2.1 总黄酮量测定 采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[7],以芦丁为标准品,测得标准曲线回归方程为:Y=0.133 5+0.000 1X, r=0.999 6。
1.2.2 核桃青皮上样液制备及其总黄酮量测定
取核桃青皮粉1 kg,用70%的乙醇回流提取4次,抽滤,合并滤液,回收乙醇至无醇味,并用蒸馏水定容至5 000mL,取少量按照1.2.1节的方法测定其总黄酮量(以质量浓度计,下同)。
1.2.3 大孔树脂的预处理 本实验根据树脂生产厂家提供资料,以95%乙醇浸泡24 h后, 4倍体积95%乙醇洗脱,控制流速1mL/min,再以大量蒸馏水洗至中性,备用。
1.2.4 不同型号树脂筛选的研究
1.2.4.1 静态吸附解吸实验 准确称取一定量处理好的各种树脂,置于100mL锥形瓶中,分别加入总黄酮质量浓度为4. 635 g/L的上样液50mL,每隔10min振摇20 s,持续2 h,静止24 h后,过滤,得液体样品,按1.2.1节操作测定其吸附后滤液质量浓度。将滤出后的树脂用蒸馏水洗去树脂表面的上样液,另置100mL锥形瓶中,精确加入70%乙醇20mL,每隔10min振摇20 s,24 h后,过滤,得液体样品,按照1.2.1节的方法测定解吸后滤液质量浓度。按照下式计算各树脂对核桃青皮总黄酮的静态饱和吸附量(mg/g)、解吸量(mg/g)和解吸率(% )。
饱和吸附量=(样液质量浓度-吸附后滤液质量浓度)×样液体积/干树脂质量;
解吸量=解吸后滤液质量浓度×解吸液体积/干树脂质量;
解吸率=解吸量/饱和吸附量×100%
1.2.4.2 动态吸附解吸实验 准确称取一定量处理好的各种树脂,湿法装柱,吸取总黄酮质量浓度为5. 186 g/L的上样液100mL,上样吸附,过柱液重吸附一次,静置12 h,蒸馏水洗脱至无色后,用70%乙醇洗脱,将各吸附后残液、水洗液、醇洗脱液浓缩至一定体积,按照1.2.1节的方法测定各部分的总黄酮量。按下列公式计算比吸附量(mg/g)、比洗脱量(mg/g)和总黄酮回收率(% )。
比吸附量=(上柱总黄酮质量-残液中总黄酮质量-水洗液中总黄酮质量) /干树脂质量;
比洗脱量=醇洗脱液中总黄酮质量/干树脂质量;
总黄酮回收率=醇洗脱液中总黄酮质量/上柱总黄酮质量×100%
1.2.5 D101树脂分离纯化核桃青皮总黄酮的工艺优化
1.2.5.1 上样量的确定 取处理好的树脂6份(相当于干树脂约4. 4 g,下同),湿法装柱,分别吸取总黄酮质量浓度为6. 175 g/L的上样液30、40、50、60、70和120mL,上柱吸附完全后用6BV(BV为柱床体积,相当于23. 7mL,下同)的蒸馏水洗柱,再用5BV的70%的乙醇洗脱,将醇洗脱液浓缩至一定体积,测定总黄酮量和回收率。
1.2.5.2 上样液浓度的确定 取处理好的树脂5份,湿法装柱,再取上样液60mL5份,一份浓缩至30mL,一份不处理,另3份分别加水稀释1、2和3倍,质量浓度依次为12. 350 0、6. 175 0、3. 087 5、2. 058 3和1. 544 0 g/L。上柱吸附完全后,用6BV的蒸馏水洗柱,再用5BV的70%乙醇洗脱,将醇洗脱液浓缩至一定体积,测定总黄酮量和回收率。
1.2.5.3 上样液pH值的确定 取处理好的树脂7份,湿法装柱,取上样液60mL用1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH,分别调pH值为2、3、4、5、6、7和8,上柱吸附完全后,用6BV的蒸馏水洗柱,再用5BV的70%乙醇洗脱,将醇洗脱液浓缩至一定体积,测定总黄酮量和回收率。
1.2.5.4 乙醇体积分数对总黄酮回收率及纯度的影响 取处理好的树脂5份,湿法装柱,取60mL上样液上柱吸附完全后,用6BV蒸馏水洗柱后,再分别用10%、30%、50%、70%、90%乙醇洗脱,每种洗脱液收集5BV,浓缩各部分液体样品,测定总黄酮量和回收率。
1.2.5.5 水洗体积对总黄酮回收率及纯度的影响 取处理好的树脂4份,湿法装柱,取60mL上样液上柱吸附完全后,分别用2、4、6和8BV的蒸馏水洗脱,再用5BV的70%乙醇洗脱,将水洗液、醇洗液浓缩到一定体积,测定各部分的总黄酮量,计算总黄酮纯度。
纯度=洗脱液中总黄酮质量/干物质质量×100%
1.2.5.6 洗脱终点的确定 取处理好的树脂适量,湿法装柱,取60mL上样液吸附完全后,用6BV蒸馏水洗柱,再用70%的乙醇洗脱,按柱床体积收集,共收集8个洗脱份,测定每个洗脱份的总黄酮量。
2 结果与讨论
2.1 6种树脂的静态-动态吸附解吸结果
用6种树脂对核桃青皮粗提液进行处理,其静态和动态的饱和吸附量、解吸率、总黄酮回收率如表1、表2所示。大孔树脂对有效成分的吸附具有可逆性,在静态和动态吸附解吸实验中,由于树脂的极性、孔径、比表面积的不同,对总黄酮吸附作用力强弱不同,解吸难易也不同。LSA21、LS303、D101三种树脂在静态吸附解吸中具有较大的吸附量和解吸量。在动态吸附解吸时,D101型树脂无论是在比吸附量、70%乙醇洗脱总黄酮质量、比洗脱量、总黄酮回收率均优于其他类型的树脂, 70%乙醇洗脱的总黄酮质量和总黄酮回收率为253. 78mg和48. 93%,比LSA40型树脂的洗脱量169. 75mg和回收率32. 73%分别高出84. 03mg, 16. 2%。故选用D101型树脂作为分离纯化核桃青皮总黄酮的适宜树脂。
2.2 D101型树脂吸附分离核桃青皮总黄酮的工艺优化
2.2.1 上样量对总黄酮回收率的影响 表3显示,当树脂量一定,增加上柱量,由于吸附不完全,过柱液和水洗液造成总黄酮流失,总黄酮回收率明显降低,同时还会导致吸附选择性变差;若上柱量过少即吸附剂用量过多,虽总黄酮回收率较高,但会使成本增高,所以上柱量与树脂量要有合理的比例关系。当上柱量与干树脂质量比为1∶12时,总黄酮回收率即可达50%以上,综合以上因素选用上柱量与干树脂质量比1∶12为宜。
2.2.2 上样液质量浓度对总黄酮回收率的影响
图1表明,在上样液总黄酮量固定的情况下,当上样液的浓度增大时,总黄酮回收率不断增大,但是当质量浓度增大到12. 35 g/L时,因浓度过大,发生絮凝和沉淀,回收率下降;而上样液浓度偏低时,时间增加,工效降低;在原液和稀释一倍的浓度下,总黄酮回收率相差不大,实际中,上样液质量浓度可在3. 087 5~6. 175 g/L范围内,所以,在本研究不考察其他因素时,选择制备好的上样液(质量浓度6. 175 g/L)直接上样,不必稀释。
2.2.3 上样液pH值对总黄酮回收率的影响 上样液酸碱度对树脂吸附有一定影响,故将上样液pH值调成2~8七种不同酸碱度的溶液,实验中发现不同pH值的上样液其澄清度差异较大。当上样液pH值为2和3时,上样液有不同程度的沉淀,特别是pH值为2时,溶液产生大量絮状沉淀,使树脂结块,堵塞树脂柱;当pH值≥5时,溶液澄清透明,上柱效果较好。
从图2可看出,随着pH值的升高总黄酮回收率逐渐增大,在pH值为5时,回收率达到最大,为57. 88%,随着pH值的升高,总黄酮回收率反而下降。这是因为在弱酸条件下,黄酮类化合物以分子形式存在,故易于被吸附。但酸性较强时黄酮分子易形成佯盐,偏碱时黄酮分子上酚羟基的氢解离形成酸根离子,黄酮类化合物形成离子结构,被树脂吸附的能力就减弱[8-9],故确定上样液适宜pH值为5。
2.2.4 乙醇体积分数对总黄酮回收率的影响
从图3可看出:随着乙醇体积分数的增加,核桃青皮总黄酮的回收率增加,当乙醇体积分数为70%时,核桃青皮总黄酮回收率的变化趋于平缓,说明核桃青皮总黄酮已经基本上被解吸下来,为节约成本,减少醇挥发带来的损失,选择70%的乙醇对树脂进行洗脱。
2.2.5 水洗体积对总黄酮回收率和纯度的影响
从图4可以看出,随着水洗体积的增加,水洗脱总黄酮量增大,总黄酮回收率下降,但纯度有所提高,考虑经济、工效以及后续工作对纯度要求,选用6倍柱体积的水洗脱较好。
2.2.6 洗脱终点的确定
从表4可以看出,当洗脱液70%乙醇用量为5BV时,总黄酮的总回收率已达到59. 07%,基本上将总黄酮大部分洗净,考虑到增加洗脱液用量,不仅增加生产成本,同时脂溶性杂质增多,故确定洗脱5BV的70%乙醇为洗脱终点。
2.3 D101型大孔树脂重复使用次数的考察按照以上筛选结果所得优化条件,重复使用树脂10个周期,测定总黄酮回收率和纯度,见表5。
由表5可看出,大孔树脂连续使用5次以后,由于核桃青皮提取物中含有大量色素,树脂颜色变深,残留在树脂上的杂质较多,使吸附能力减弱,核桃青皮总黄酮的回收率和纯度都有所下降,需要进行再生处理。
3 结论
3.1 D101型大孔树脂对核桃青皮总黄酮具有良好的吸附和解吸性能,用其纯化核桃青皮总黄酮是可行的。
3.2 D101型大孔树脂分离纯化核桃青皮总黄酮的最佳条件是:上样液总黄酮与干树脂质量比1∶12,上样液质量浓度为3. 087 5~6. 175 g/L范围内, pH值为5,依次用6倍体积蒸馏水、5倍体积70%乙醇洗脱,总黄酮回收率60%,纯度80%以上。该工艺具有收率高、成本低、操作简便、溶剂安全等特点,适宜在大规模生产中选用。
参考文献:
[1]李志美.核桃的开发利用[ J].林业调查规划, 2004, 29(增刊): 199-200.
[2]林天慕,管清香,张三奇,等.大孔树脂分离纯化独一味总黄酮的研究[J].中国药学杂志, 2005, 40(4): 264-268.
[3]贝伟剑,彭文烈,罗杰.柿叶黄酮的大孔吸附树脂分离提纯富集[J].中成药, 2005, 27(3): 257-262.
[4]吕洁丽,杨中汉,袁珂.新型凝胶树脂及大孔树脂在中草药成分分离纯化中的应用[J].中草药, 2005, 28(3): 239-244.
[5]郭丽冰,周洁珍,朱盛山.大孔吸附树脂分离纯化麻黄及洋金花总生物碱的研究[J].食品与药品, 2006, 8(5): 47-50.
[6]史作清,施荣富,范云鸽,等.树脂吸附法在中草药有效成分提取中的应用[J].中草药, 2001, 32(17): 660-662.
[7]王冬梅,李琰,杨秀萍.大孔吸附树脂提取分离翅果油树叶总黄酮的研究[J].西北植物学报, 2003, 23(9): 1621-1624.
[8]卢锦花,胡小玲,岳红,等.大孔吸附树脂对银杏叶黄酮类化合物吸附及解吸的研究[J].化学研究与应用, 2002, 14(2):164-166.
[9]马希汉,王冬梅,苏印泉.大孔吸附树脂对杜仲叶中绿原酸、总黄酮的分离研究[J].林产化学与工业, 2004, 24(3): 47-52.
